尼康荧光显微镜的原理与结构图
尼康荧光显微镜的原理与结构图 由有机和无机样品的光的吸收，随后再辐射通常是既定的物理现象作为荧光或磷光的结果。通过光的发射荧光过程几乎是同时地吸收的激发光的光子的吸收和发射，取值范围通常小于一微秒的持续时间相对较短的时间之间的延迟。当发射仍然存在更长的时间后已经熄灭的激发光，该现象被称为磷光。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/e8ceca478f3ddfc9576c592db2ba40c4.jpg 首先描述英国科学家乔治爵士G.斯托克斯于1852年，是负责这一术语时，他观察到的矿物萤石发出红光，当它被照亮的紫外线激发荧光。斯托克斯指出，总是发生在比激发光的波长更长的荧光发射。在19世纪早期的调查表明，当用紫外线照射时，许多标本（包括矿物，晶体，树脂，生药，黄油，叶绿素，维生素，和无机化合物）荧光。然而，直到20世纪30年代开始使用荧光染料染色的组织成分，细菌和其他病原体的生物调查。几个这些污渍具有较高的特异性，刺激的荧光显微镜的发展。 荧光显微镜技术在生物学和生物医学科学，以及在材料科学，由于在其他对比度模式与传统的光学显微镜不容易获得的属性已经成为一个必不可少的工具。数组的荧光染料中的应用已成为可能，以确定细胞和细胞成分亚微观非荧光材料具有高度的特异性之中。事实上，在荧光显微镜能够揭示单个分子的存在下。通过使用多个荧光标记，不同的探针可同时识别多个物镜分子同时进行。虽然在荧光显微镜不能提供低的空间分辨率的衍射极限的特定试样的功能，低于该范围内的荧光分子的检测，可以容易地获得。 各种标本表现出的自体荧光（不含荧光染料的应用），当他们被照射，这种现象已彻底在植物学，岩石学，半导体产业等领域的利用。相比之下，动物组织和病原体的研究往往是复杂的，要么极其暗淡或明亮的，非特异性的自发荧光。更大的值，后者的研究的是，加入的荧光染料（也称为荧光团），特定波长的光照射被激发并发光定义的和有用的强度。荧光染料污渍依附可见光或子可见的结构，往往是高度特异性的针对自己的依恋，有一个显着的量子效率（比吸收光子发射）。利用荧光显微镜的广泛增长是密切相关的新的合成的和天然的与已知的强度分布的激发和发射荧光团的发展，以及很好理解的生物物镜。激发和发射基础 荧光显微镜的基本功能是有所需的和特定频带的波长照射试样，然后分离出更弱的发射荧光的激发光。在适当配置的数字显微镜，只的发射光到达眼睛或检测器，使所得到的荧光结构叠加有高对比度和（或黑色）的一个非常黑暗的背景。一般的检测限受黑暗的背景下，激发光通常是几十万到一百万次发出的荧光亮度比。 在图1所示的是一个现代的两个发射和反射荧光显微镜落射荧光显微镜的剖面图。在该图的中心的垂直照明器具有在其一端（标记的落射灯箱）和过滤器立方体炮塔的另一位置的光源。该设计包括一个基本的显微镜，其中反射光的反射光的波长长于激发。约翰S. Ploem入账垂直照明反射光荧光显微镜的发展。在荧光垂直照明，光的特定波长（或定义的波长带），经常在紫外，蓝色或绿色区域的可见光谱，通过来自光源的电弧放电灯或其他源通过一个多光谱激发波长选择性的过滤器。通过激发光滤光片的波长反映从一个二色反射镜或分束器（也称为二向色性）的表面上，通过显微镜的物镜浴中的试样强烈的光线。如果样品发出荧光，通过由物镜聚集的发射光通过二色镜，随后过滤通过一个势垒（或发射）滤波器，该滤波器阻止不需要的激发波长。重要的是要注意，荧光试样，激发后，产生自己的光在光学显微镜下是唯一的模式。所发出的光在所有方向上，球的再辐射的激发光源方向无关。 落射荧光照明是压倒性的选择技术在现代显微镜，观察观察镜筒和物镜转换器壳体的物镜之间的反射光垂直照明。所述照射器被设计为直接光照射到试样上，首先通过的激发光通过显微镜物镜（在此配置中，作为一个聚光镜）的方式向试样，然后使用相同的物镜，以捕获发射的荧光。这种类型的照明器具有几个优点。作为校正聚光镜和第二服务第一作为图像形成的光收集者的荧光显微镜的物镜。作为一种单组分，物镜/聚光镜总是完美对齐。达到试样的激发光的大部分通过无相互作用，行驶相差的物镜，和被照射区域被限制为（在大多数情况下）通过目镜观察。不像一些对比增强技术的情况，全面客观的数值孔径是科勒照明显微镜时，而正确的配置。最后，它是可能的结合，或交替使用反射光的荧光和透射光观察和捕获的数字图像。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/977b75feb81652f44128fcaa8579827f.jpg 如在图1中，反射光垂直照明器包括一个电弧放电灯管外壳的后端处（通常是一个汞或氙气燃烧器）。激励光沿垂直照射器，通过的集电极透镜和一个变量，定心的孔径光阑，然后通过一个变量，定心的视场光阑（参见图1）通过显微镜的光轴。然后，光入射激发光滤光片选择所需的波段和不需要的波长阻塞发生。所选择的波长，通过激发滤光片后，达到的二色性分束镜，这是一个专门的干涉滤光器，可以有效地反射波长更短的光有效地通过较长波长的光。二色性分束器在相对于接收到的激励光成45度的角度倾斜时，这反映了在一个90度角，直接通过物镜光学系统，和到标本的照明。由物镜收集被照射试样所产生的荧光发射，在其通常的图像形成功能的服务。因为所发射的光由较长的波长比激发照明，它是能够通过二色镜上方观察管或电子检测仪。 达到的二色镜的激发光的散射反射回光源，虽然分钟数量往往穿过并吸收由反射镜块的内部涂层。发出的荧光可以到达目镜或探测器之前，它必须首先通过通过屏障或抑制滤波器。该过滤器块（抑制）的任何残余激励光，并传递所需的较长的发射波长。在大部分的反射光照明装置中，激发滤光器，二色镜，和屏障过滤器引入到一个光学块（通常称为作为一个多维数据集），如在图2中示出。现代荧光显微镜能够容纳四至六名荧光的多维数据集（通常在一个旋转的炮塔或通过滑块机构;见图1），并允许用户轻松地将更换售后激发和屏障过滤器，以及双色镜。 垂直照明设计应该使用户能够调整显微镜科勒照明，提供明亮，均匀的照明，光圈在整个视野。的聚光透镜的光学系统的校正应确保定心孔径光阑的图像共轭的后孔径集中的物镜。预聚焦，定心视场光阑的形象在现代照明，重点标本和固定目镜膜片的平面共轭。 照明灯箱通常采用红外光抑制滤波器。灯箱本身不会泄漏有害的紫外线的波长，优选地，应设有一个开关自动关闭灯泡壳体在操作过程中不经意地打开。灯箱应该坚固，足以承受一个可能在操作过程中爆炸燃烧器（弧光放电灯）。的灯座在现代lamphouses的，配备有调节旋钮，以允许中心的弧光灯的图像内的物镜（科勒照明光学系统中，这些平面是共轭）的后孔。在光路中，通常接近灯箱和激发滤光片前的某处，它是试样时，不被观看或与检测器成像，以完全阻止激发光，希望有一个快门。此外，中性密度滤光片的规定应当提供（无论是在车轮上，转塔，或滑块），以使用户以减少的激励照明的强度。斯托克斯位移 放松当电子从激发态回到基态，振动能量损失。的能量损失的结果，激发荧光团的发射光谱通常转移至较长的波长相比的吸收光谱或激发光谱（注意，波长成反比的辐射能量）。这种现象被称为斯托克斯定律或斯托克斯位移记录。斯托克斯位移值增加，它变得更容易分离发射光激发，通过使用荧光滤光片组合。 的荧光发射（或吸收）的强度峰值的波长和幅度比通常较低，所表现出的激发峰，发射光谱轮廓（曲线）是通常的镜像图像（或接近）的励磁曲线，但转移到较长的波长，如图3中所示的Alexa Fluor 555，一个有用的探针的黄绿色区域中吸收光，产生橙黄色发射。通常，为了实现最大荧光强度，荧光团（通常称为染料）或激发曲线的峰值波长附近的激发，并尽可能广泛的包括发光峰的发光波长的选择的检测。激发和发射波长的选择通常是基于干涉滤光器（图2）。此外，显微镜光学系统的光谱响应也将取决于玻璃的传输效率（由于防反射涂层），透镜和反射镜元件的数目，和检测器系统的响应度等因素。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/b7c24622f735da20edebb641c9a3e3bf.jpg 激发和发射波长的有效分离和检测的实现在荧光显微镜中，通过适当选择过滤器，以阻止或通过特定波长带中的紫外线，可见光和近红外光谱区。，平衡器）向试样的方式插入到光路中，并再次在检体之间的路径和控制的应用，容易地更换过滤器（中性密度和干扰激发的激发光通过的目的而设计的荧光的垂直照明器观察管或相机检测系统。也许最重要的标准，在相对低的荧光发射强度（见上面的讨论），是用于激发光源是足够的亮度，可以最大化的弱的发光，并且，荧光染料具有足够的吸收性能和发射量子产率。 的效率的特定荧光团的激发光的吸收一个光子的分子横截面是一个函数，被称为消光系数和吸收的可能性。更大的消光系数，在一个给定的波长区域的吸收一个光子（或量子）是更有可能的。的量子产率表示的量子数之比，发射出比吸收（通常是在0.1和1.0之间的一个值）。低于1的量子产率的值是通过非辐射的途径，如热或光化学反应，而不是重新辐射通路的荧光能量的损失的结果。消光系数，量子产率，平均的光源的发光强度，荧光寿命的荧光发射的强度和效用都是重要的因素。衰退，淬灭，漂白 宽谱的条件往往开始发挥作用，最终影响到重荧光发射的辐射，从而降低强度。荧光强度降低的总称衰落，一个包罗万象的所有类别，通常是进一步细分为更精确的描述淬火和漂白现象。光漂白，因为它们的相互作用与分子氧在发射前是处于激发态的荧光分子的不可逆分解。漂白的发生被利用的技术称为荧光漂白后恢复（FRAP），一个非常有用的机制，为研究生物大分子的扩散和运动。该方法是基于漂白后大幅定义区域的标本由强烈的激光脉冲，伴随着随后的观察光漂白区域的荧光恢复的速率和模式。一个相关的技术，被称为荧光漂白损失（FLIP），荧光监测减少躺在相邻的光漂白区域定义的区域。类似的FRAP，后者的技术是有用的在活细胞中的分子运动性和动力学调查。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/893e8f77aab72f7070af82b21f31aa19.jpg 图4展示的是光漂白（衰落）中观察到的一系列为乘法染的文化印度人麂鹿表皮的成纤维细胞的在不同时间点拍摄的数字图像的一个典型例子。双 - 苯并咪唑衍生物（Hoechst公司33258，蓝色荧光）的细胞核进行染色，而在线粒体和肌动蛋白细胞骨架与MitoTracker红CMXRos（红色荧光）和鬼笔环肽衍生物，共轭的Alexa Fluor 488（绿色荧光）的染色分别。时间点在两分钟的时间间隔，用荧光过滤器组合与调整，激发荧光基团，同时也记录合并发射信号带宽。请注意，所有三个荧光团具有相对高的强度在图4（a），但的Hoechst荧光强度（蓝色）开始快速下降，在两分钟内，在6-8分钟内几乎完全消失了。线粒体和肌动蛋白的污渍更耐漂白，但两者的强度显着下降的过程的时间序列（10分钟）。 通过各种机制涉及非辐射能量损耗和经常发生降低的荧光强度的猝灭结果激发态的弛豫过程作为氧化剂或盐或重金属或卤素化合物的存在下的结果。在某些情况下，淬火的能量传递到另一个分子（称为受体），这是位于物理上接近的激发的荧光基团（供体），这种现象被称为荧光共振能量转移（FRET）的结果。这种特殊的机制，已成为一种有用的技术，涉及距离远低于光学显微镜的横向分辨率的分子间的相互作用和关联的研究的基础。荧光光源 排放水平低，在大多数荧光显微镜应用的一个不幸后果是，到达眼睛或相机探测器的光子数也非常低。光学显微镜的收集效率，在大多数情况下，是小于30％，许多荧光基团的浓度在微摩尔或纳摩尔地区范围的光路中。为了产生足够的激发光的强度产生检测到的排放量，强大的紧凑的光源，如高能量的短弧放电灯，是必要的。最常见的灯的汞的燃烧器，在瓦数范围从50至200瓦，氙气燃烧器，从75至150瓦的范围内（参见图5）。这些光源通常采用外部直流电源，家具足够的启动电源，通过电离的气态蒸气点燃燃烧器，保持它闪烁最低燃烧。 在显微镜弧放电灯的外部电源通常是配备一个带有计时器，跟踪燃烧器已经在运行的小时数。弧光灯，失去效率和更容易碎裂，如果使用超出其额定寿命（200-300小时）。汞燃烧器不提供均匀的强度在整个频谱从紫外到红外灯泡的强度大部分花费在近紫外。突出强度峰值出现在313，334，365，406，435，546和578纳米。在其他波长在可见光区域，强度稳定，但几乎没有这么亮（但在大多数应用中仍然可用）。在考虑发光效率，光灯的瓦数是不是首要的考虑因素。取而代之的是，关键的参数是必须加以考虑的平均亮度，同时考虑到发射源的亮度，弧线的几何形状，角度扩展。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/8f4fdcac8fe5b9601ee0568ad8c13459.jpg 在过去的几年中，光学显微镜经历了增加在应用程序中的激光光源，尤其是氩离子，氪氩离子激光器。这些激光源尺寸小，低发散，近monochromicity，平均亮度高的优点。他们已成为在扫描共聚焦显微镜技术，这种技术已被证明是一个强大的工具，在渲染非常尖锐的荧光图像，通过拒绝非聚焦光除去试样焦平面至关重要。通过点或线重合通过复合孔径成像扫描共聚焦显微镜完成这个任务。的标本的光学部分可以被存储在一个主计算机，并重构为最终的图像，然后将其显示在监视器上。过滤器术语 作为一个结果，利用由不同的制造商，以确定他们的过滤器的各种缩写和代码混乱已成为常见的术语适用于荧光显微镜的功能组合。基本上有三大类过滤器：激励（通常简称为励磁），障碍（排放），两色分光镜（或分色镜）。荧光过滤器以前几乎完全从染色玻璃或明胶夹在两个玻璃板之间的构造。然而，目前的趋势是制造高清晰度干扰光学激发滤光片过滤器与一个伟大的特异性和高传输的波长的光通过或拒绝。双色分光镜是专门旨在反映或通过特定波长的光时，放置在一个45度角（见图1和图2）入光路的干扰滤波器。阻挡过滤器制造与有色玻璃或干扰涂料（或两者的结合） 制造商雇用的缩写识别激发滤光片的属性包括：UG（紫外线玻璃）和BG（蓝色玻璃）。往往表示Shortpass过滤器KP（K表库尔兹，德语的意思是“短”的缩写），或简称为SP。现在，一些制造商的标签指定IF干扰滤波器。窄带激发干涉滤光片是特别有用的，如果斯托克斯转变是小。 缩略语或缩写阻隔过滤器包括：LP或L长通滤波器，为黄色或盖尔布（德国）的玻璃，ŗ或RG红色玻璃，OG或Ø橙色的玻璃，K表坎特，德国术语边缘Ÿ或GG（过滤器），以及BA屏障过滤器。当过滤器的类型也与一个数字，如BA515，该指定是指，在50％的它的最大传输的波长（纳米）。 双色分光镜还包括CBS在内的众多缩写所描述的一个色分束器，DM分色镜，TK “teiler坎特”，德国为“teiler FARB” 边缘分离器，FT（德国颜色分配器），和RKP反思短传。所有这些术语应该被认为是可以互换的，现代的二色性分束器总是与干扰涂层的光学玻璃（如有机或金属染料相对）制造的。更长的波长更短的波长和高的传输的目的是产生高反射率的薄膜的干扰。二色性分束器在一个45度角进入光学块的激发光，通过反射光荧光照明器的路径取向。它们的主要功能是重新定向选择的激励（较短的）波长通过物镜到标本。在这些专门的过滤器也有通过较长波长的荧光发射的屏障过滤器，并反映在灯箱的方向的任何散射的激发光反射回的附加功能。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/0df8452e4aa6befffae07550e763f742.jpg 图6给出了一个典型的荧光现代显微镜中使用的过滤器的组合的传输的档案。激发滤光片光谱（红色曲线）表现出高的水平（约75％），在450和490纳米与470纳米的中心波长（CWL）之间传输。二色镜（黄色曲线）反映了在该区域的激发光谱的波长，通过较高和较低的波长时，以相对较高的效率。需要注意的是0％的透射二色镜曲线上对应于100％的反射。的突出浸在450和500纳米，这表示峰的反射率之间的传输特性文件，用于反映通过在一个90度的角度，到样品上的激发光滤光片的波长频带。中的最终组件的光的列车，排放量或屏障过滤器（白色曲线），发射波长在的绿色可见光区域，在520和560纳米之间的范围内。的各种叠加的光谱的透射和反射的波长带之间的界限被设计成尽可能陡峭的反射和透射的波长，以确保几乎完全分离。正弦上升沿和下降沿尖峰出现在二色镜光谱的图案，是一种常见的薄膜沉积过程被称为振铃效应。过滤器组合的表现，这是显着的，并，实现薄膜 干涉滤光片技术的迅速发展，是一个明确的示范。 尼康所采用的过滤器的命名源于条款可以追溯到20世纪90年代初的混合物。当时，所有的尼康互补滤波器组合使用硬涂层溅射技术，但许多目前可用的过滤器利用新型柔软的涂层方法生产。虽然软大衣更容易受到湿度和热降解，且必须更仔细地处理比硬涂层过滤器，他们表现出更高的阻挡光密度值，，微调特定波长频带，并提供更大的方便。了解尼康过滤器组合代码命名规则提供了一种机制，迅速 确定是否特定的一组特定的荧光将充分履行。 尼康专有的字母数字滤波器的指定代码的第一个字母表示的波长的激发光谱区域（例如，UV，V，B，和g，这是简单的缩写紫外线，紫色，蓝色，绿色，分别）。激发后的代码的数量涉及激发滤波器的通带的宽度：1中和宽的频带激励的窄频带激励，2，和3很宽的频带激励。最后，一个或多个字母的激发带通大小号码标识的屏障过滤器的特点。代码字母à表示一个标准的长通屏障过滤器以最低的截止波长，而乙指定较高的临界波长值一个长波发射滤波器的。带通发射滤波器中带有字母的ê（指“增强”），表明其优越的性能方面，以消除交叉。E / C滤波器是柔软的毛发干扰组合设计特异性探针，如DAPI，FITC，TRITC，州和得克萨斯州红获得最佳性能。荧光预算 在一个典型的荧光显微镜的光束估计是有用的概述生产数字图像，或在视觉上观察标本时会遇到的约束。在本练习中，假设激励源，是一个标准的75瓦氙放电灯的平均光通量密度约400坎德拉每平方毫米（其他来源，见表1）。当灯泡的输出被收集并引导通过一个490纳米的干涉滤光器（具有10纳米的带宽和75％的透射），约2毫瓦的光通过。由二色镜，一个90％的效率为1.8毫瓦的光束反射后的显微镜物镜作为激发光束进入后孔。 随着100x物镜的数值孔径为1.4的试样照明系统的面积将是12×10×E（-6）平方厘米，假设一个圆形，直径约40微米的视图字段。在试样上的光束，然后约每平方厘米150瓦，它对应的磁通密度为3.6×10×E（20）每平方厘米的光子。因此，试样的光照强度是在一个阳光明媚的日子，事件对地球表面约1000倍以上。 上面所讨论的，光束的结果依赖的荧光发射的荧光团的吸收和发射特性，它的浓度在试样和试样的光路长度。在数学方面，产生的荧光（F）由下式给出：F =σ×Q×I 其中σ是分子的吸收截面，Q是的量子产率，I是入射光束（按上述方式计算）。假设荧光素的荧光团的吸收截面（σ）为3×10×E（-16）平方厘米每分子，Q等于0.99，所得的值F的每分子每秒100000光子。如果染料浓度为1微摩尔每升，均匀地分布在40微米直径的盘，其厚度为10微米（体积等于12微微升），约1.2×10×E（-17）摩尔的染料或7.2万分子在光路中。如果所有的分子同时被激发的荧光发射率是7.2×10×E（11）的光子每秒（F和数量的染料分子的商品）。利息问题是多少发出的光子将被检测到，上述排放率可以继续多久？选择光源的发光密度
灯电流
（安培）光通量
（流明）平均光
密度（CD /毫米2）圆弧尺寸
（高x宽）
（毫米）
汞弧
（100瓦）5220017000.25×0.25
氙弧灯
（75瓦）5.48504000.25×0.50
氙弧灯
（500瓦）30900035000.30 x 0.30
钨
卤素灯82800454.2×2.3
表1 检测效率的光的收集效率和检测器的量子效率是一个函数。甲1.4数值孔径以100％的传送物镜（一个不切实际的条件），有一个最大的收集效率，大约30％的接受角限制。二色镜的传输效率的屏障过滤器的85％和80％。全面收集效率约20％或140亿光子每秒。如果检测器是一个传统的电荷耦合器件（CCD），绿色荧光发射（525纳米）的量子效率是50％左右，所以检测到的信号将有70亿光子每秒约10％的发射荧光。即使有一个完美的检测器（100％量子效率），只有大约20％的荧光发射的光子可以被检测到。 荧光发射的持续时间依赖于荧光基团的破坏率作为漂白结果。荧光在含氧生理盐水溶液，测量结果表明，每个分子只能被销毁之前发出约36,000光子。在无氧的环境中，光破坏的速度减少约10倍，所以每360,000光子荧光分子。整个染料池，在该示例（720万的分子），然后将能够产生一个最小为2.6×10×E（11）及最大为2.6×10×E（12）的光子。假设上述计算每个分子每秒100,000个光子的发射率，荧光可能持续仅0.3～3秒前光破坏。在被检测到的光子通量的10％的情况下，为7.2×10×E（10）电子每秒信号将通过以下方式获得。 按照本实施例的参数，如果检测器是一个1000×1000像素的CCD相机，该信号将被分布超过一百万的传感器，每个传感器约72,000电子。对于一个科学级CCD与9微米见方的传感器，全井的存储容量大约是80,000个电子和读出噪声小于10个电子。将在很大程度上取决于该signal-to-noise比等于光子统计噪声信号的平方根，约268。在几乎所有的情况下，这种高信号电平只能持续一个非常简短的一段时间，光破坏发生之前。大多数的显微镜利用的妥协，以延长观察期内是减少在入射光束的强度，以便只在染料池的荧光团分子的一小部分被激发，并进行光破坏。因此，信号 - 噪声比很少等于理论上的最大值，并通常在荧光显微镜中的10和20之间的范围内。单分子检测 在理想的条件下，它往往是未能检测到的荧光发射，其前提是从一个单一的分子的光的背景和检测器的噪声是足够低的。正如上面所讨论的，单一的荧光分子可能会释放出多达30万的光子被摧毁前漂白。假设有20％的收集和检测效率，约60,000光子将被检测到。雪崩光电二极管或电子倍增CCD探测器，这些实验中，研究者已经能够监控许多秒甚至几分钟的单个分子行为。主要的问题是足够的光抑制背景噪声。因为许多建设显微镜镜头和过滤器所用的材料显示某种程度的自体荧光，最初努力朝向非常低的荧光元件的制造。然而，它很快变得明显，荧光显微镜技术，利用全内反射（TIR）低背景和高激发光通量提供所需的组合。 全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜）利用渐逝波，所开发的光时，具有不同的折射率的两种介质之间的界面处的全内反射。图7（a）中示出的原理，采用外部光源。在这种技术中，光束的光（通常是一个扩展的激光束）被引导通过棱镜的折射率高，如玻璃或蓝宝石，紧靠低折射率介质的玻璃或水溶液。如果光被引导到以高于临界角的棱镜，光束将被全内反射的界面处。反射现象的发展的界面处渗透到约200纳米或更小的折射率低的空间的电磁场产生的渐逝波。倏逝波的光的强度足够高内激发出荧光，但由于其深度较浅，兴奋的是非常小的体积。因为这么少的试样接触到的激发光（只有这部分的接口内的200纳米的距离），其结果是一个非常低的电平的背景。http://www.pooher.com/d/file/xinwen/Technical/2013-04-18/30337018e4ed76cd0f4aa3f363098b69.jpg 也可以通过落射照明的变形进行全内反射荧光显微镜接近利用宽视场技术（图7（b）中示出）。此方法需要一个非常高的数值孔径的物镜（至少为1.4，但优选为1.45～1.6）和从一个侧面部分的显微镜视场照明由一个小的运动或由薄环的更均匀的照明。高折射率透镜的液浸介质和显微镜盖玻璃需要实现全内反射造成的照明角度。图7（b），退出物镜前透镜元件的光的角度小于临界角（记为A（1） ）在图7的（b））中提出的传输相差显微镜。当增加或超过临界角的角度（表示角度A（2）在图7（b）），全内反射的结果。 其他流行的先进的荧光技术，如荧光共振能量转移（FRET）和荧光漂白后恢复（FRAP），以及光谱，往往是结合与内部全反射来实现额外的信息。其结果是一个非常强大的工具，研究个别荧光基团和荧光标记分子。从研究单个分子的性质所产生的优势才刚刚开始被赞赏。因此，现在光学显微镜的电流范围从单分子延伸到整个动物。
结论 现代荧光显微镜结合的高性能光学元件与电源计算机控制仪器和数字图像采集到实现的复杂程度远远超过简单的观察到人的眼睛。电子成像显微镜现在在很大程度上取决于在低光照水平或在视觉检测不到的波长快速获取信息。这些技术上的改进不是单纯的门面，但是光镜下作为一个系统的重要组成部分。 光学显微镜时，纯粹是描述性的工具或智力玩具的时代已经过去。 目前，光图像形成的是数据分析的第一步。在显微镜来完成结合的电子检测器，图像处理器和显示设备的成像系统的扩展，可以被看作是这第一步。电脑控制的焦点，舞台上的地位，光学元件，百叶窗，过滤器，和探测器是在广泛使用和使力所能及的机械显微镜实验操作。在荧光显微镜中的电子光学系统的应用越来越普遍，导致能够操纵亚细胞结构或颗粒，单分子成像，和复杂的光谱应用广泛的光镊的发展。
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