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1.白细胞计数及分群计数 全血标本用稀释液在仪器的外部或内部进行一定比例的稀释，再加入一定量的溶血剂,使红细胞全部破坏，随后被倒入一个不导电的容器中，将小孔管（板）,也称为传感器（transducer）插到细胞悬液中，小孔是电阻抗法细胞计数的一个重要成分，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，其外侧细胞悬液中有一个外电极。检测期间，当电流接通后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流，细胞悬液通过有固定直径和厚度的小孔向小孔内部流动，计数孔直径一般＜100μm，厚度为75μm左右。因为小孔周围充满了具有传导性的液体，其电子脉冲是稳定的。如供给的电流I和阻抗Z是稳定的，根据欧姆定律通过小孔的电压E也是不变的（这时E＝IZ）。当悬液中一个细胞通过小孔时，因血细胞有极小的传导性，细胞导电性质比等渗的稀释液要低，在电路中小孔感应区内电阻增加，于瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号，这被称为通过脉冲，电压增加的程度取决于细胞体积，细胞体积越大，引起的电压变化越大，产生的脉冲振幅越高。通过对脉冲大小的测量可测定出细胞体积，记录脉冲的数目可得到细胞计数的结果；经过对各种细胞所产生脉冲大小的电子选择，可区分不同种类的细胞，并进行分析。
从电阻抗的原理可看出，不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小不同，而不同类型的白细胞（如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞）经溶血剂作用后有明显的差异，因此根据脉冲的大小，即可人为地将血内的白细胞分成几群（二分群或三分群）。目前，在临床应用中，称之为“二分类”、“三分类”血液分析仪的概念是不确切的。因为白细胞分类是指在显微镜下，观察经染色的血涂片，根据细胞形态（包括细胞胞体大小；胞浆的颜色及量的多少；胞浆中颗粒的颜色、大小及数量；核的形状及染色质的特点）综合分析，得出准确均一的细胞群。也就是说，如分类结果淋巴细胞是25%，意味着分类100个白细胞中准确地有25个淋巴细胞。而电阻法白细胞“分类”实际上是根据溶血剂作用后的白细胞体积大小的分群，其测量的标准只是根据白细胞体积的大小，而体积大小并不是细胞形态惟一的指标。比如，经溶血剂作用后有些嗜碱细胞可落入小细胞群，而大淋巴细胞可落到“中间”或“大细胞群”。显微镜下，单核细胞较粒细胞体积大，而经溶血剂作用后，粒细胞体积大于单核细胞。因此，在解释血液分析仪白细胞“分类”的结果时，“淋巴”细胞在仪器分类时只认定为体积与淋巴细胞体积相似的小细胞群，在这群体中，可能90%的白细胞是淋巴细胞，而绝不是均一细胞群体。这种差异在病理情况下更大，这也就是专家们反复强调电阻抗法白细胞“分类”不能代替显微镜涂片检查之所在。
那么，仪器是如何进行细胞分群的呢？目前，很多仪器除给出细胞数据结果外，同时提供出细胞体积分布图形，这些表示出细胞群体分布情况的图形称为直方图（histogram）。它可显示出某一特定细胞群的平均细胞体积、细胞分布情况和是否存在明显的异常细胞群。直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲累积得到，根据库尔特原理可在计数的同时进行分析测量。如图1所示，左图为示波器显示的所分析细胞的脉冲大小，右图为相应的体积分布直方图，横坐标为体积，纵坐标为相对数量。血液分析仪在进行血细胞分析时，将每个细胞的脉冲数根据其体积大小分类，并储存在相应的体积通道中。从每个通道收集的数据统计出细胞的相对数量（REL No.），表示在“y”轴上；细胞体积数据以fl 为单位，表示在“x”轴上。
例如，在进行白细胞体积分析时，仪器的计算机部分可将白细胞体积从一定体积范围35～450fl分为若干通道256个通道（channel），本节例举的仪器白细胞体积范围35～450fl分为通道256个通道,每个通道约为1.64fl，不同体积细胞被数目进入相应通道中，从而得到白细胞体积分布的直方图。不同档次仪器设置的通道数目不同,直方图形也不同。
电阻抗测定方法得到的白细胞分类数据是根据白细胞体积直方图计算得来的.经过溶血剂处理后的白细胞，根据体积大小可初步确认其相应的种类：第一亚群（小细胞群）主要是淋巴细胞；第二亚群是中间细胞区，也有仪器这区域主要是单个核细胞（如单核细胞、幼稚细胞）故称为单个核细胞,在正常时有单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，在病理情况下异常淋巴细胞、幼稚细胞、白血病细胞可出现在这个区域；相当于粒细胞大小的细胞位于第三亚群（大细胞群）。仪器根据各细胞群占总体的比例计算出各细胞群的百分比，再与该标本的白细胞总数相乘，即得到各项的绝对值。
如标本中有未成熟细胞、异常细胞或非典型细胞，有些三分群的血液分析仪在报告单上可打出报警符号（flags）“R”，并能指出哪一个区域有异常细胞及异常细胞的种类。
较好类型的血液分析仪应用计算机数据处理终端(Data Terminal，DT )通过对计数结果和体积分布直方图的分析，可以对病人结果作出一些提示性诊断建议，给出含义性报告(Interpretive Report，IR )，以帮助临床医生尽快作出正确的判断。如果一个标本的结果是正常的，报告上可提示分布正常(NORMAL DISTRIBUTION)并无警告符号。如果一个标本的结果是异常的，报告上打出警告符号，并写出含义性报告提醒你注意，。含义性报告程序可以给出三种不同类型的提示：可疑(Suspect)、操作者定义(operator- definabIe)和项目警告符号(ParameterFlags)。
2.红细胞计数和红细胞比容测定原理 迄今，大多数血液分析仪仍使用电阻抗法进行红细胞计数和红细胞比容测定，其原理同白细胞检测一样。红细胞通过小孔时，形成相应大小的脉冲，脉冲的多少即红细胞的数目，脉冲的高度代表单个脉冲细胞的体积。脉冲高度叠加，经换算即可得红细胞的比容。有的仪器先以单个细胞高度计算红细胞平均体积，再乘以红细胞数，得出红细胞比容（hematocrit，HCT）。仪器根据所测单个细胞体积及相同体积细胞占总体的比例，可打印出红细胞体积分布直方图。应该指出，被稀释的血细胞混悬液进入红细胞检测通道时，其中含有白细胞，红细胞检测的各项参数均含有白细胞因素。但因正常血液有形成分中白细胞比例很少（红细胞∶白细胞约为750∶1），故白细胞因素可忽略不计。但在某些病理情况下，如白血病，白细胞明显增加而又伴严重贫血时，均可使所得各项参数产生明显误差。
3.血红蛋白测定原理 任何类型的血液分析仪，血红蛋白测定原理都是相同的。即被稀释的血液加入溶血剂红细胞溶解，释放的血红蛋白与溶血剂中有关成分结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长下比色，吸光度的变化与液体中血红蛋白含量成正比，仪器便可报告其浓度。不同系列血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物亦不同，吸收光谱各异，但迄今的血细胞分析仪选择使用的方法血红蛋白衍生物最大吸收均接近540nm。这是因为国际血液学标准委员会(International Committe of Standred Hematology ICSH）推荐的氰化高铁（HiCN）法，HiCN最大吸收在540nm。校正仪器必须以HiCN值为标准。大多数系列血液分析仪溶血剂内均含有氰化钾，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白（注意不是氰化高铁血红蛋白）。其特点是显色稳定，最大吸收接近540nm，但吸收光谱与HiCN有明显不同，此点在仪器校正时应十分注意 。为了减少溶血剂的毒性，避免含氰血红蛋白衍生物检测后的污物处理，近年来，有些血液分析仪使用非氰化溶血剂（如，月桂酰硫酸钠血红蛋白，sodium lauryl sulfate，SLS法）。实验证明，形成的衍生物（SLS-Hb）与HiCN吸收光谱相似，检测结果的精确性、准确性达到含有氰化物溶血剂同样水平。既保证了实验质量，又避免了试剂对分析人员的毒性和环境污染。
4.各项红细胞平均指数检测原理 同手工法一样，平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、红细胞体积分布宽度（red cell volume distribution width，RDW），均是根据仪器检测的红细胞数、红细胞比容和血红蛋白含量检验数据，经仪器程序换算出来的。
5.血小板检测原理 血小板随红细胞一起在一个系统中进行检测，因血小板体积与红细胞体积有明显的差异，仪器设定了特定的阈值，将高于阈值者定于红细胞，反之为血小板，检测数据经仪器内部的计算机处理后分别给出血小板与红细胞数目。一般血小板计数设置64个通道，体积范围在2～30fl之间。不同仪器的血小板直方图范围可能不一。血小板平均体积（mean platelet volume ，MPV）就是此平整曲线所含的群体算术平均体积，所以，MPV也就是PLT体积分布直方图的产物
流式法血液分析仪有各种类型，使用的分析技术各异且各有自己的专利技术，这就形成了“五分类”血细胞分析仪型号的多样化。这类仪器白细胞计数原理大致相同。即仪器利用“鞘流”“扫流”技术，使混悬在样品的细胞单个成束排列通过激光检测器进行细胞计数。本节只介绍白细胞分类计数原理。
1.流式技术结合物理检测方法检测 (1).多角度偏振光散射分析技术（MAPSS）血液分析仪原理 仪器结合流式细胞仪中的液流聚焦技术－双鞘液原理，以氦氖激光为光源，利用其独特的多角度偏振光散射（multi angle polarized scatter separation，MAPSS）分析技术对细胞进行检测分析。
当全血标本经过鞘液稀释形成细胞悬液，与鞘液分别进入流动室。因两者流速及压力均不一样，从而形成一个直径因两者流速及压力均不一样，从而形成一个直径大约30μm的液体管道，使细胞悬液中的细胞颗粒单个排列，一个接一个地通过激光检测区，这就是流式细胞仪中常采用的液流聚焦原理。仪器通过检测细胞颗粒，对垂直入射的激光在4个独特角度的散射强度。其中：①0°（ 1°～3°）前向散射光强度检测反映细胞大小，同时检测细胞数量。②10°（7°～11°）小角度散射光强度检测反映细胞结构以及核质复杂性。③90°（70°～110°）垂直角度散射光强度检验反映细胞内部颗粒及分叶状况。④90°D（70°～110°）垂直角度的消偏振光散射强度检测，反映的是基于嗜酸性粒细胞的嗜酸颗粒可将垂直角度的偏振光消偏振的特性，从而将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分辨出来。仪器将每个细胞的4个角度散射光的数据进行综合分析，从而完成白细胞分类
(2).VCS白细胞分类技术 VCS分别是体积（volume）、传导性（conductivity）和光散射（scatter）的缩写，这一分类过程使用专一试剂，对标本进行正确处理。两种试剂（erythrolyseTM 和stabilyse TM）先后加入混匀池内，与血液标本混匀，从而溶解红细胞而使白细胞保持在未改变或“近原态”状态。其中，红细胞溶解剂erythrolyseTM的作用是溶解红细胞，然后加入白细胞稳定剂StabilyseTM，作用是中止溶血反应并使留下的白细胞恢复到原态用以进行分析。
这一系统包括有一个石英晶体制成的流动池，采用液力聚焦术使白细胞通过流动池，使白细胞单个排列呈现在检测系统。在单一通道，采用三个独立的检测技术同时检测一个细胞，在流动池内共检测8 192个白细胞。将体积、传导性和光散射的参数结合起来，从而直接测量5种白细胞的分群。
体积：VCS利用库尔特的电阻抗原理来测量处于等渗稀释液中的完整原态细胞的体积。无论细胞在光路中的方向如何，这种方法都能准确地测量出所有大小的细胞。这一信息可用来纠正传导性和光散射信号，给出强有力的库尔特独特的双重测量数据。
传导性：电磁波范围内的交流电可通过细胞膜穿透细胞。利用具有强大潜能的探针，用以收集有关细胞大小和内部构成的信息，包括细胞的化学组成和核体积。通过纠正传导信号使它不受细胞大小影响，我们可获得只与细胞内部构成相关的测量信息。这种新的测量探针，也叫阻光性，使得VCS技术可利用细胞内部构成的不同，将大小相近的细胞区分开来。同时，仪器通过计算出细胞核/细胞浆比值，用来区分异型淋巴细胞和正常淋巴细胞。
光散射：VCS系统内的氦-氖激光发出的一束椭圆形的光束，可用来收集细胞颗粒信息、核分叶情况及细胞表面特性。库尔特血液分析仪消除了光散射信号中的有关体积的部分，给出了一个叫做旋转光散射（rotated light scatter，RLS）的新测量参数。这样，就可选择每种细胞最佳的光散射角度并设计出能覆盖这一范围（10°～70°）的散射光检测器。VCS技术利用这种方法无需经数学处理便可准确地把混合的细胞（如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）区分成不同的细胞亚群，这种方法还能提高非粒细胞群之间的分离。
每个细胞通过检测区域时，根据它的体积（Y轴），传导性（Z轴）和光散射（X轴）特点，被定义到三维散点图中的相应位置。在散点图上，所有单个细胞的位置就形成了相应细胞的群落。最后,得出白细胞分类计数的结果
2.流式技术结合化学方法检测 (1).流式细胞术结合核酸染色血液分析技术 新一代的五分类血液分析仪不仅强调分类的准确性，而且更加突出对异常标本的筛选能力，这必然会促进五分类方法学的改进。原理则更多地加用生物化学法或细胞化学染色的方法进行多参量检测。单纯采用物理方法进行五分类检测，不能有效地对形态各异的原始细胞或异常细胞进行分析，而借助生物化学的方法，根据不同细胞在不同成熟时期对各种溶血试剂、组化染料和荧光染料的反应性不同，将其细胞生物特性并转化为差异较大的物理学特征之后，再进行物理学方法检测。
XE-2100使用了核酸荧光染料以增强细胞检测的敏感性。仪器以半导体激光器为光源，波长633nm。为了配合红色波长的半导体激光器，Sysmex公司首次采用了近蓝色的荧光染料聚次甲基（polymethine），它可对细胞胞浆中的核酸物质（RNA/DNA）进行染色。在检测侧向散射光时，XE-2100检测侧向90°散射光，以提高对细胞核形态的分辨能力，同时也可满足侧向90°荧光的检测。
XE-2100使用了两个通道检测五类白细胞。在DIFF通道中，根据不同白细胞类型和不同成熟度的细胞对荧光染料的着色能力不同，检测散射光信号和荧光信号就可区分出淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/嗜碱性粒细胞。为了区分中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，设立了单独的BASO通道，其中加入表面活性剂，使除嗜碱性粒细胞以外的白细胞溶解破碎，只剩下裸核，而嗜碱性粒细胞可抵抗表面活性剂的溶解保持细胞的完整。因完整的嗜碱性粒细胞和裸核之间的体积差异可表现为散射光信号的差异，因此检测散射光信号可准确区分中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
此外，在自动血液分析中低值血小板的检测一直是个难点。采用传统的阻抗法检测技术，单纯靠细胞体积一个检测参数，无法有效区分其他干扰物质，特别是无法区分病理标本中的大血小板、小红细胞、红细胞碎片和大的网织红细胞，XE-2100除采用常规的阻抗法外，还采用核酸荧光染色技术检测血小板，得到光学法血小板参数（PLT-O），仪器可根据光学血小板的检测结果，对病理标本阻抗法检测的血小板数自动加以校准。 3.双鞘流DHSS五分类血液分析仪原理 双鞘流五分类血液分析仪，通过白细胞计数通道（WBC/HGB），双鞘流通道（double hydrodynamic sequential system，DHSS），嗜碱细胞通道（BASO/WBC）3个通道的相互协作完成白细胞五分类分析和异常白细胞的测定。
(1)．WBC/HGB检测通道 应用无氰化物的溶血剂，采用鞘流阻抗法和比色法进行白细胞和血红蛋白的测定，白细胞为256分析通道。Pentra 120中有2个辅助通道（DHSS和BASO/WBC），分别进行白细胞的计数，所得结果与WBC/HGB通道的白细胞结果进行比较，称为平衡检测技术，保证白细胞计数和分类的准确性。Pentra 120DX在WBC/HGB,DHSS,BASO/WBC, 网织红细胞（reticulocyte，RET）4个通道中同时进行白细胞的计数和比较，在网织红细胞检测通道中可把有核红细胞从白细胞的计数中扣除，保证了白细胞结果的准确可靠。
白细胞平衡检测原理（WBC balance）：在WBC/HGB通道中的白细胞计数结果与DHSS双鞘流池及WBC/BASO通道结果相联系,当DHSS通道中的结果超过或低于白细胞参考计数通道（WBC/HGB,WBC/BASO）时，按设定的偏差范围，仪器会自动提示LMNE报警,从而保证了白细胞分类结果的准确可靠。
(2). DHSS（双鞘流）通道 是此类仪器白细胞分类的核心技术，联合流式细胞化学染色技术，吸光比率法，聚焦流阻抗法3种方法对白细胞进行精确分析。细胞化学染色液（eosinfix）对细胞脂质和蛋白组分进行染色，其中对单核细胞初级颗粒，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色。散点图中同时能得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞和巨大未成熟细胞的结果。
1）DHSS技术：流式通道中有2个检测装置： ① 60mm鞘流微孔用于细胞体积的测定。② 42mm的光窗测定吸光比率用于分析细胞的内容物。细胞经鞘流稀释液作用，排列在流式通道中央，细胞经第一束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积，然后经第二束鞘流后，到达光窗进行细胞的光散射及光吸收的测定，分析细胞的内部结构。DHSS通道应用此技术，实现了对大量细胞进行依次、准确、快速的测定。
2）时间检测装置（time fixed device）：DHSS检测时间的固定设计，能保证每个细胞依次通过鞘流微孔，检测细胞体积，并在200ms内细胞应到达光窗，检测细胞光散射/吸收，进行细胞内容物的分析。此检测装置能有效防止气泡及静电的干扰，保证获得高精度的白细胞的分类结果。
3）细胞化学染色技术：是经典的细胞分类方法，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料（chlorazol Black E）。在仪器的DHSS检测池中，全血标本与染色剂充分混匀，在35°下进行孵育，此过程的反应过程为： ① 溶解红细胞。 ②对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）也进行不同程度的着色。 ③ 固定细胞的形态，使其保持自然状态。因淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同，每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光比率。
4）标本自动混匀系统：血液分析仪测定的为全血标本，所以标本的匀一性是保证结果重复性和准确性的关键环节。ABX采用了360°旋转混匀技术，能保证全血标本达到最佳的混匀状态。ABX自动采样针，采用了自下而上穿刺通过标本管帽方式抽取标本，最大限度的减少因真空管的真空度不足使采血量减少而导致的仪器吸样的误差。
(3).BASO/WBC通道：在WBC/BASO检测池中，全血标本与BasolyseII溶血素混合，在35℃恒温下，溶解红细胞，因嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能保持形态完整，而其他白细胞胞浆溢出，成为裸核状态。细胞通过鞘流微孔（80μm），每个细胞产生与细胞体积成比例的电子脉冲，绘制WBC/BASO直方图。依据阈值设定，区分白细胞裸核与嗜碱性粒细胞，能准确测定嗜碱细胞和白细胞（监测功能）。
4.激光过氧化物酶染色分析技术 这类仪器检测原理是利用激光散射和过氧化物酶染色技术进行白细胞计数及分类.仪器有4个测量通道：(1)过氧物酶测量通道（白细胞分类）、(2)嗜碱性粒细胞/分叶核测量通道、(3)红细胞/血小板测量通道、（4）血红蛋白测量通道。
1.过氧化物酶通道白细胞检测原理 因嗜酸性粒细胞有很强的过氧化物酶活性，中性粒细胞有较强的过氧化物酶活性，单核细胞次之，而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无此酶。将血液经过过氧化物酶染色，胞浆内部即可出现不同的酶化学反应。当这类细胞通过测量区时，因酶反应强度不同和细胞体积大小差异，激光束射到细胞上的前向角和散射角不同，以透射光检测酶反应强度的结果为X轴，以散射光检测细胞体积为Y轴，每个细胞产生两个信号结合定位在细胞图上，近而得到白细胞分类结果。
2.嗜碱性粒细胞/分叶核通道的测量原理 此通道用于嗜碱性粒细胞计数幼稚细胞.
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发表于 2015-6-29 14:18:46
